Активность экстракта меланина в отношении вируса гриппа

Данную работу проводили на перевиваемой культуре клеток MDCK. Сначала при добавлении разных разведений препаратов к монослою клеток MDCK определяли концентрации экстрактов, оказывающих токсическое действие на клетки, с использованием инвертированного микроскопа. Для исследования противовирусной активности брали те разведения экстрактов, которые не оказывали токсического действия на клетки MDCK. Противовирусную активность препаратов оценивали в отношении штамма вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1). Наличие вируса в среде культивирования клеток MDCK определяли через 2 сут после их инфицирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами кур.

Культуры клеток. Для тестирования противовирусной активности препаратов использовали перевиваемую культуру клеток MDCK, полученных из коллекции культур клеток ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор». Клеточную культуру MDCK получали из лаборатории в виде суспензии с указанной концентрацией. В стерильном месте суспензию разводили предварительно подогретой до температуры +37°C средой Axcevir - MDCK до концентрации 1×105 клеток/мл. По 100 мкл суспензии клеток MDCK вносили в 96-луночные планшеты 12-канальной автоматической пипеткой. Планшеты с клетками помещали в термостат при температуре +37°C, 5% CO2 и 100% влажности на 2-3 сут до образования клеточного монослоя.

Для определения токсических доз препаратов экстракты разводили несколько раз и оценивали наличие токсического действия в монослоях культуры клеток MDCK с помощью инвертированного микроскопа. Для этого делали разведения исходного препарата в 2 раза, в 10, 50, 100, 500, 1000, 10000 раз средой Axcevir - MDCK, вносили по 150 мкл в соответствующие лунки планшета и ставили в термостат при температуре +37°C, 5% CO2 и 100% влажности на 2 сут. Через 2 сут с помощью инвертированного микроскопа оценивали наличие токсического действия в монослоях клеток MDCK, инкубированных с разными концентрациями грибных экстрактов. На следующем этапе для определения противовирусной активности грибных экстрактов брали максимально переносимые концентрации (МПК) и меньшие. Токсичная доза для клеток MDCK (разведение 1:100) составляла 0,25 мг/мл.

Вирус. В работе использовали штамм вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) и штамм вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2) из коллекции ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», наработанные на 10-суточных куриных эмбрионах (КЭ). Концентрацию вируса в исследуемых образцах определяли путем титрования на КЭ или на клетках MDCK, рассчитывали и выражали в lgЭИД50/мл (десятичных логарифмах 50% эмбриональных инфицирующих доз в мл) или в lgТЦД50/мл (десятичных логарифмах 50% тканевых цитопатических доз в мл), соответственно, по методу Спирмана-Кербера. Наработанные и использованные в работе серии вирусаллантоисной жидкости (ВАЖ) со штаммами вируса гриппа хранили при -70°C.

Концентрации вируса в вирусаллантоисной жидкости (ВАЖ) составляли по разным экспериментам от 6,3 до 8,3 lg ЭИД50/мл (50% эмбриональных инфицирующих доз в мл).

Готовили разведения ВАЖ от 1 до 8 с десятикратным шагом с использованием среды Axcevir-MDCK, содержащей 2 мкг/мл трипсина. Для определения противовирусной активности препаратов в монослой культуры клеток MDCK вносили по 50 мкл выбранного разведения экстракта и 100 мкл разведения ВАЖ. Заражение клеточного монослоя проводили по общепринятой методике, при этом для культивирования вирусов использовали поддерживающую среду Axcevir - MDCK (Stem Alpha, Франция), содержащую 2 мкг/мл трипсина ТРСК (Sigma, США). Клетки инкубировали 2 сут при температуре +37°C в атмосфере 5% CO2 в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Через 2 сут в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали ЦПД в монослое клеток и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами кур.

В качестве контроля использовали:

1) контроль клеток MDCK, культивируемых в питательной среде Axcevir - MDCK (Stem Alpha, Франция), содержащей 2 мкг/мл трипсина ТРСК (Sigma, США), без вируса и без препаратов;

2) контроль репродукции вируса гриппа в разведениях с 1 до 8 с десятикратным шагом в клетках MDCK, культивируемых в питательной среде Axcevir - MDCK (Stem Alpha, Франция), содержащей 2 мкг/мл трипсина ТРСК (Sigma, США), без внесения разведении грибных экстрактов.

В табл.1 представлены данные по определению противовирусной активности меланина в отношении вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) на клетках MDCK.

Как видно из табл.1, индекс нейтрализации вируса раствором меланина составил 2,2 lg, эффективная доза водного раствора меланина при этом была 0,02 мг/мл.