Меланин против герпеса

Штамм MS вируса простого герпеса 2-го типа (ВПГ-2) был получен из Американской коллекции типовых культур (АТСС). В ГНЦ ВБ "Вектор" вирусный штамм прошел 1 пассаж на культуре клеток Vero. До начала работ исходную суспензию, содержащую вирус, хранили в жидком азоте. Штамм Egypt 101 (Eg101) вируса Западного Нила (ВЗН) был получен из Государственной коллекции вирусных штаммов ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (Москва, Россия).

Определение токсичности проб для клеток. Для определения токсичности на клетки в 96-луночные планшеты с культурой клеток Vero вносили экспериментальные пробы, которые предварительно были разведены на питательной среде DMEM (ГНЦ ВБ "Вектор"), содержащей 5% сыворотки. Экспозицию проводили в течение 1 часа при 37°C в атмосфере 5% CO2. Затем клетки трехкратно промывали средой DMEM без сыворотки и заливали средой DMEM с 2% сыворотки крупного рогатого скота (ООО "БиолоТ", Москва), прогретой до 56°C. Наблюдение за состоянием клеток, обработанных препаратами и в контрольных, необработанных рядах, проводили в течение семи суток при помощи световой микроскопии. Нетоксичной для клеток Vero по данной методике была исходная концентрация 25,0 мг/мл.

Экспериментальные образцы стерилизовали путем фильтрования через фильтр 0,2 мкм (Millipore, США).

Определение антивирусной активности. Изучение антивирусной активности грибных проб проводили, руководствуясь методами, представленными в Руководстве по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ и статьей Госфармакопии (Государственная фармакопея СССР. Общие методы анализа. Лекарственное сырье. - М.: Медицина, 1990. - II изд. - Вып.2. - том 2. - С.187-209). Снижение инфекционного титра вируса оценивали после инкубации вирусной суспензии с экспериментальными препаратами в течение часа при 37°C. Далее, эти суспензии препаратов с вирусом вносили в лунки 96-луночных планшетов с культурой клеток. После адсорбции в течение 1 часа при 37°C монослой клеток промывали средой без сыворотки и заливали поддерживающую среду. Снижение инфекционного титра вируса, обработанного или инактивированного пробами, выражали для вируса простого герпеса 2-го типа (ВПГ-2) в бляшкообразующих единицах (БОЕ). Результаты учитывали визуально при ежедневном наблюдении в световой микроскоп. Протоколы заполнялись на каждые сутки наблюдений. В тот день, когда выявляли ЦПД в лунках контрольного ряда титрования вируса (для ВПГ-2 обычно на 2-3 сут), учитывали результат титрования ВПГ-2 в БОЕ, и инактивации вируса исследуемыми препаратами, то есть меньшее количество или отсутствие 10-100 БОЕ для ВПГ по сравнению с контролем.

Результаты исследований показали полное подавление развития вируса ВПГ-2 на культуре клеток Vero происходило при очень низких концентрациях меланина. Эффективная доза составляла 0,006 мг/мл