Противовирусное действие экстракта меланина на репродукцию вируса иммунодефицита человека

Токсичность образца водного раствора меланина исследовали с использованием лимфоидной культуры клеток человека МТ-4. Для этого суспензию клеток МТ-4, разведенную до посевной концентрации 0,5×106 клеток в миллилитре питательной средой RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки, предварительно инактивированной прогреванием при 56°C в течение 30 минут, 300 мг/мл L-глютамина, 80 мкг/мл гентамицина и 30 мг/мл линкомицина, помещали в лунки 96-луночных планшетов по 180 мкл в лунку. К клеткам добавляют раствор меланина (по 20 мкл в лунку), до конечных разведений 1:10, 1:20, 1:40, 1:80…1:1280. Максимальная исследованная концентрация меланина на культуре клеток МТ-4 в тесте на «токсичность» составляла 300 мг/мл. Использовали по 3 лунки на каждую дозу. Контролем служили клетки, в которые вместо исследуемого соединения добавляли то же количество растворителя (среда RPMI-1640 без сыворотки и антибиотиков). Планшеты инкубировали в термостате при 37°C. На 5 сутки культивирования подсчитывали концентрацию и жизнеспособность клеток методом прижизненного окрашивания клеток МТТ (3-(4,5-dimethylthiazol-2-y1)-2,5-diphenyltetrazolium bromide). Результат учитывали на спектрофотометре Anthos при 570-620 нм. Разведение, оказывающее 50% токсическое действие на клетки МТ-4 (при котором клетки сохраняли 50% жизнеспособность, ТС50), определяли по графику зависимости оптической плотности от концентрации и жизнеспособности клеток. В результате эксперимента определяли 50% токсическую концентрацию меланина (ТС50) для культуры клеток МТ-4, которая составила 200 мкг/мл.

Противовирусное действие меланина оценивали по подавлению вируспродукции в клетках МТ-4. В суспензию клеток МТ-4 добавляли вируссодержащий материал (ВИЧ-1, штамм ГКВ 4046), клетки разносили по лункам 96-луночных планшетов. Одновременно в лунки вносили образец меланина, разведенный в среде RPMI-1640, с шагом 3-кратных последовательных разведений препарата (1:3, 1:9, 1:27 и т.д.), по три лунки на каждую дозу. Планшеты инкубировали в течение часа при 37°C для адсорбции вируса, затем клетки разводили до посевной концентрации питательной средой RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки, предварительно инактивированной прогреванием при 56°C в течение 30 минут, 300 мг/мл L-глютамина, 80 мкг/мл гентамицина и 30 мг/мл линкомицина, содержащей соответствующие дозы меланина. Контролями служили инфицированные ВИЧ-1 клетки МТ-4 без добавления меланина. Планшеты инкубируют при 37°С в атмосфере 5% CO2 в течение 5 сут.

Анти-ВИЧ активность меланина (IC50) оценивали по методу МТТ (сравнительная оценка жизнеспособности инфицированных ВИЧ-1 и неинфицированных клеток МТ-4) и по подавлению накопления вирусного белка р24 в инфицированных ВИЧ-1 клетках с использованием количественного определения р24 методом прямого иммуноферментного анализа. 50% ингибирующая концентрация меланина (IC50) в отношении ВИЧ-1 в экспериментах с использованием культуры клеток человека МТ-4 методом МТТ составила 1,3 мкг/мл. Подавление прироста вирусспецифического белка р24 различными разведениями меланина определяли с помощью тест-системы производства «Вектор-Бест». Результат учитывали на спектрофотометре BioRad при 450 нм. Базовый уровень белка р24 в момент инфицирования составил 6,67 нг/мл (lg 6,67=0,8241). Концентрация белка р24 через 5 дней при культивировании ВИЧ-1 на клетках МТ-4 без добавления меланина составила 1,03×104 нг/мл (lg 1,03×104=4,0128), при этом 50% подавление прироста вирусспецифического белка р24 происходило при добавлении меланина в концентрации 2,6 мкг/мл. Усредненные данные по двум независимым методам оценки противовирусной эффективности препарата показали, что меланин обладает способностью к 50% подавлению репродукции ВИЧ-1 при концентрации 1,95±0,65 мкг/мл, индекс селективности (ТС50/IC50) для меланина превышает 100.

В табл.3 приведены результаты изучения токсического и противовирусного действия меланина в отношении ВИЧ-1.

Оценка эффективности противовирусного действия меланина на культуре клеток человека МТ-4, инфицированной ВИЧ-1, показала, что при низкой токсичности (ТС50 составляет 200 мкг/мл) экстракт меланина обладает способностью к 50% подавлению репродукции ВИЧ-1 при концентрации 1,95±0,65 мкг/мл (пример 1), индекс селективности (ТС50/IC50) для меланина превышает 100. Пример подтверждает, что меланин оказывает выраженный ингибирующий эффект в отношении вируса иммунодефицита человека I типа.