Противовирусное действие экстракта меланина на репродукцию вируса оспы

Вирус осповакцины (ВОВ), штамм Л-ИВП был получен из коллекции ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» и наработан на культуре клеток Vero с титром 5×105 БОЕ/мл.

Культура клеток. Культура клеток Vero была получена из коллекции культур клеток ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор». Для получения монослоя клетки выращивали в течение 1-3 суток в 96-луночных пластиковых планшетах в питательной среде (100 мкл/лунку): среда ДМЭМ, содержащая 125 мкг/мл канамицина, 150 мкг/мл L-глутамина и 2% эмбриональной сыворотки плодов коров (Fetal Bovine Serum, HyClone, Lot. No. CSC0518), инактивированной при 56°C в течение 30 мин).

Противовирусное действие экстракта меланина. Противовирусное действие препарата оценивали, используя метод (Paragas J., Whitehouse C.A., Endy Т.Р., Bray M. A simple assay for determining antiviral activity against Crimean-Congo hemorrhagic fever virus // Antiviral Research. - 2004. - V 62. P.21-25).

Меланин с исходной концентрацией 25 мг/мл разводили в питательной среде семь раз с трехкратным шагом. К содержащимся в лунках с монослоем клеток Vero 100 мкл питательной среды добавляли по 50 мкл разведении препарата, включая и препарат без разведения (нулевое разведение). Концентрация меланина в лунках планшет составляла 6,25; 2,08; 0,69; 0,23; 0,08; 0,025; 0,0086 и 0,0029 мг/мл. Каждое разведение препарата было внесено в шесть лунок. В три из них был внесен вирус, разведенный в питательной среде, в объеме 50 мкл в дозе 1000 БОЕ, а в три внесено по 50 мкл питательной среды - эти лунки использовались для определения токсичности препарата. По шесть лунок было использовано для контроля вируса и контроля клеток.

Планшеты инкубировали при 37°C в CO2 инкубаторе в течение 5 суток, ежедневно с помощью инвертированного микроскопа, наблюдая состояние клеточного монослоя и убеждаясь, что через 5 суток в лунках с вирусом, но без препарата (контроль вируса) наблюдается полное 100% цитопатическое действие вируса.

Окраска планшетов производится с помощью витального красителя нейтрального красного и основана на поглощении красителя живыми клетками. Для приготовления основного раствора красителя 3,33 г сухого красителя растворяли в 1 л дистиллированной воды, раствор фильтровали через бумажный фильтр и хранили +4°C. Перед употреблением 1 часть раствора красителя смешивали с 2 частями питательной среды, полученный раствор подогревали до +37°C и в объеме 50 мкл вносили в лунки планшет. Планшеты возвращали в CO2 инкубатор на 1,5 часа. После инкубации среду из планшет удаляли, и лунки планшет промывали двукратно физиологическим раствором (по 300 мкл/лунку). Оставшийся в лунках краситель нейтральный красный растворяли, добавляя в лунки по 100 мкл раствора 50% этилового спирта и 50% 0,1М NH4H2PO4 (pH 3.5). Планшеты выдерживали 30 мин при комнатной температуре и измеряли оптическую плотность (ОП) раствора в лунках при длине волны 490 нм с помощью планшетного спетрофотометра, соединенного с компьютером.

Анализ данных. Противовирусное действие экстракта меланина оценивали по увеличению ОП в лунках, содержащих препарат, и вирус по сравнению с контролем вируса. Для построения кривой зависимости ОП от концентрации препарата в лунках использовали опцию «4-Parameter» программы SOFTmax PRO, version 4.0. С помощью данной программы определяли ингибирующую 50% концентрацию препарата (IC50) - концентрацию препарата, при которой 50% клеточного монослоя остается защищенным от действия вируса, а также токсическую 50% концентрацию препарата (TC50) - концентрацию препарата, при которой 50% клеточного монослоя повреждается за счет токсического действия самого препарата. ТС50 и IC50 были вычислены как средние величины из трех значений, полученных при проведении эксперимента на одном планшете. Индекс селективности (SI) был вычислен как отношение ТС50 к IC50 (Duraffour S, Snoeck R, de Vos R, van Den Oord JJ, Crance JM, Garin D, Hmby DE, Jordan R, De Clercq E, Andrei G. Activity of the anti-orthopoxvirus compound ST-246 against vaccinia, cowpox and camelpox viruses in cell monolayers and organotypic raft cultures // Antivir Ther. 2007; 12(8):1205-16).

Результаты изучения эффективности противовирусного действия экстрактов меланина в отношении осповакцины представлены в табл.4.

На основании представленных в табл.4 данных можно заключить, что экстракт меланина, полученный из Inonotus obliquus, обладает противовирусной активностью в отношении вируса осповакцины (индекс селективности SI=12,5).